KROMATOGRAFI KOLOM

1.      Berdasarkan interaksi komponen dengan adsorben

a.      Kromatografi adsorbsi

Dalam kromatografi adsorbsi, komponen yang dipisahkan secara selektif teradsorbsi pada permukaan adsorben yang dipakai untuk bahan isian kolom. 

b.      Kromatografi partisi

Dalam kromatografi partisi, komponen yang dipisahkan secara selektif mengalami partisi antara lapisan cairan tipis pada penyangga padat yang bertindak sebagai fase diam dan eluen yang bertindak sebagai fase gerak.

c.       Komatografi petukaran ion

Kromatografi petukaran ion memishkan komponen yang berbentuk ion. Komponen-komponen tersebut yang terikat pda penukar ion sebagai fase diam secara selektif akan terlepas/terelusi oleh fase gerak.

d.      Komatogrfi filtrasi gel

Dalam kromatografi filtrasi gel, kolom diisi dengan gel yang permeabel sebagai fase diam. Pemisahan berlangsung seperti proses pengayakan yang didasarkan atas ukuran molekul dari komponen yang dipisahkan.

2.      Berdasarkan gaya yang bekerja pada kolom

a.      Kromatografi kolom gravitasi

Dalam kromatografi kolom gravitasi, eluen bergerak berdasarkan gaya gravitasi atau perkolasi.

b.      Kromatografi kolom tekanan

Dalam kromatografi kolom tekanan, eluen bergerak karena adanya pemberian tekanan pada kolom. Tekanan yang diberikan tidak terlalu rendah dan tidak terlalu tinggi.

3.      Berdasarkan jenis fasa diam dan fasa gerak

a.      Kromatografi Fase Normal

Kromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya “normal” bersifat polar, misalnya silica gel, sedangkan fase geraknya bersifat non polar.

b.      Kromatografi Fase Terbalik

Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar, sedangkan fase geraknya bersifat polar; kebalikan dari fase normal.

C.    Adsorben

Silika gel (SiO₂) dan alumina (Al₂O₃) adalah 2 adsorben yang paling umum digunakan untuk kromatografi kolom. Ukuran partikel dari adsorben sangat berpengaruh pada bagaiman eluen bergerak melewati kolom. Partikel yang lebih kecil (mesh lebih besar) digunakan untuk kromatografi kolom tekanan sedangkan adsorben dengan ukuran partikel yang lebih besar digunakan untuk komatografi kolom gravitasi. Alumina lebih sering digunakan dalam kromtografi kolom dibanding kromtografi lapis tipis. Daya adsorbsi alumina dapat diatur dengan mengatur jumlah air yang dikandung. Caranya ialah dengan mengeringkan alumina pada suhu 360 0C selma 5 jam, kemudian membiarkan alumina kering  tersebut menyerap air sampai jumlah tertentu. Aktivitasnya tergantung dari kadar airnya dan dinyatakan dalam skala Brockman.

D.    Pelarut

Pelarut mempunyai peranan yang penting dalam mengelusi sampel yang dapat menentukan keberhasilan pemisahan secaa kromatografi kolom. Pelarut yang mampu menjalankan elusi terlalu cepat tidak akan mampu mengadakan pemisahan yang sempurna. Sebaliknya elusi yang terlalu lambat akan menyebabkan waktu retensi yang terlalu lama.

Sistem pelarut dengan kepolaran yang bertingkat sering juga digunakan adalah pelarut mengelusi kolom. Dalam hal ini pelarut yang pertama kali digunakan adalah pelarut non polar untuk mengelusi komponen yang kurang polar. Pelarut yang lebih polar ditambahkan untuk mengelusi komponen yang lebih polar juga.

E.     Syarat-syarat Adsorben dan Pelarut

·         Harus  memiliki luas permukaan besar internal. Kecepatan adsorbsi akan semakin bertambah dengan semakin kecilnya ukuran diameter adsorben.

·         Harus mudah diregenerasi

·         Tidak cepat kehilangan kapasitas serap

·         Pemilihan pelarut tergantung dari sifat kelarutannya, akan tetapi lebih baik untuk memilih suatu pelarut yang tidak tergantung pada kekuatan elusi sehingga zat-zat elusi yang lebih kuat dapat dicoba. “kekuatan” dari zat elusi adalah daya penyerapan pada penyerap dalam kolom.

F.     Peralatan

·         Wadah eluen (fase gerak).

·          Kolom, biasanya terbuat dari gelas yang berfungsi sebagai penunjang fase diam. Pada bagian dasar dari kolom mempuny bentuk sedemikian rupa agar fase diam dapat tetap dalam keadaan statis. Terdapat glass woll atau kapas, atau bahan dari pasir kuarsa yang dikemas dengan kolom.

·         Wadah penampung, untuk menampung Eluat dari kolom dalam bentuk fraksi-fraksi. Pada dasarnya penampung dapat dilakukan secara manual, namun jik total volume dari eluat besar dengan setiap fraksi yang diinginkan dalam volume kecil, maka diperlukan suatu alat penampung tertentu. Untuk hal ini biasanya digunakan suatu alat penampun otomatis yng dikenal sebagai kolektor.

G.    Prosedur Kerja

a)      Prosedur Untuk Kromatografi Kolom Gravitasi

Ø  Pengemasan Kolom

Pengemasan kolom adalah salah satu faktor penting untuk untuk mempeoleh hasil pemisahan yang baik. Ada 2 cara pengemasan kolom (packing) dalam kromatografi kolom gravitasi, yaitu:

Metode basah

Adsorben dicampur dengan pelarut, kemudian campuran dimasukkan ke dalam kolom. Keuntungan dari metode ini adalah gelembung udara dapat dihilangkan dari kolom. Contoh: kolom diisi dengan pelarut non polar seperti hekasana kira-kira setengah dai tinggi kolom gels. Ditimbang sebnyak 8 gram alumina dalam gelas piala sementara erlenmeyer 125 diisi 15 ml heksana. Dengan perlahan serbuk alumina ditambahkan sedikit demi sedikit sambil diaduk. Gunakan pipet pasteu untuk membut bubur, kemudian dengan cepat bubur tersebut dipipet dan dimasukkan ke dalm kolom. Tempatkan erlenmeyer di bawh kolom kemudian buka screw clamp dan biarkan pelarut mengalir. Teruskan penambahan bubur alumina sampai habis, jangan lupa penambahan pelarut heksana terus dilakukan dan pelarut heksan yang keluar dapat ditampung dan digunakan kembali untuk packing/menambah lagi alumina ke dalam kolom. Jika packing sudah selesai, screw clamp ditutup, tinggi cairan minimal sma dengan tinggi alumina. Kadang-kadang pasir juga ditmbahkan pda puncak kolom untuk mencegah dari gangguan saat pelaut baru ditambahkan.

Metode kering

Metode ini lebih mudah tapi dapat menimbulkan adanya gelembung udara dalam kolom. Gelembung udara ini harus dihindari, karena akan mengurangi resolusi dari pemisahan. Contoh: Bagian dasar dari kolom diisi dengan glass woll secukupnya. Pinch clamp ditutup dan kolom diisi dengan pelrut. Masukkan 8 gram alumina ke dalam kolom gelas yang berisi pelarut dan biarkan pelarut mengalir. Pinch clamp ditutup jika packing sudah selesai dan tinggi pelarut minimal sama dengn tinggi alumina. Demikian juga hindai agar kolom tidak kering.

Pebandingan antara volume total kolom (cair+padat) dengan diameter kolom yang optimal agar dipeoleh pemisahan yang baik, sulit dinyatakan secara tepat dan ini dilakukan secara coba-coba secara sistematis. Secara umum, hanya dapat dinyatakan bahwa kemasan kolom yang panjang akan memberikan tingkat pemishan yang tinggi dan kolom yang lebar adalah baik untuk memisahkan komponen-komponen dalam jumlah besar. Jenis fase diam yang digunakan adalah silika gel dan alumina.

Ø  Aplikasi sampel dan Proses Elusi

Sebelum sampel dimasukkan ke dalam kolom, pelarut dikeluarkan sedemikian rupa hingga cairan di atas fase diam hmpir kering. Smpel dimasukkan pada bagian atas dari fase diam dengan bantuan pipet tetes. Sejumlah kecil pengelusi (fase gerak) digunakan untuk mencuci sissa sampel dalam wdah sampel dan selnjutnya dimsukkan ke dalam kolom.

Setelah sampel dimasukkan, biasanya ditambah lagi eluen sedemikian rupa hingga ketinggian fase gerak di atas fase diam 5-10 cm. Selanjutnya, hubungkan dengan wadah fase gerak (proses elusi dilakukan) dan alirkan pengelusi sedemikin rupa sehingg ketinggian cairan di atas fse diam dipertahankan. Proses elusi dilakukan sampai komponen yang diinginkan keluar dari kolom.

Ø  Pengumpulan Fraksi

Pengumpulan fraksi dapat dilakukan secara manual dengan menggunakan tabung reaksi yang sebekumnya diberi tanda sesuai dengan volume yang diinginkan atau pada waktu tertentu yang ditetapkan sebelumnya. Pengumpulan ini dapat juga dilakukan secara otomatis dengan bantuan kolektor fraksi. Jika tidak ada prosedur tentang jumlah tiap fraksi yang harus dikumpulakn maka biasanya diambil pendekatan yakni 2-5% dari volume total (cair+padat).

Ø  Deteksi Komponen

Deteksi komponen dapat dilakukan dengan teknik analisis seperti cara-cara spektoskopi, KLT, dsb.

b)     Prosedur Untuk Kromatografi Kolom Tekanan Skala Mikro

Kromatografi kolom tekanan skala mikro merupakan metode yang paling sering digunakan dalam laboratorium kimia organik karena mudah dilakukan dan ramah lingkungan. Pemisahan terbaik jika jumlah sampel berkisar 25 mg.

Ø  Pengemasan kolom

Kolom dikemas dengan metode kering. Bagian bawah pipet pasteur disumbat dengan kapas secukupnya. Tambahkan silika gel kering 230-400 mesh.

Ø  Pra elusi kolom

Untuk digunakan pelarut non polar sepeti hekasana. Heksana ditambahkan pada bagian atas kolom (silika gel). Pelarut akan bergerak dengan perlahan, proses pra elusi dpat dipercepat dengan bantuan bulb pipet untuk mendorong pelarut melewati silika gel. Ketika batas pelarut sudh mencapai batas bawh dari kolom, proses elusi selesai dan kolom siap digunakan.

Ø  Aplikasi sampel

Metode basah

Sampel dilarutkan dalam sejumlah kecil pelarut sepeti heksana, aseton dan sebagainya. Larutan ini kemudioan dimasukkan ke dalam kolom.

Metode kering

Sampel dilarutkan salam sejumlah kecil pelaut dan tambahkan 100 mg silika gel. Tunggu sampai pelarut menguap sehingga yang tertinggal hanya serbuk kering. Masukkan sampel ke dalam kolom dengan bantuan kertas. Tambahkan pelarut segar ke dalam kolom dan proses elusi pun siap dimulai.

Ø  Elusi kolom

Proses elusi untuk kromatografi kolom tekanan berskala mikro dilakukan dengan cara menekan bulb yang ada di ujung pipet pasteur sehingga pelarut akan bergerak melewati kolom. Jangan biarkan fase diam sampai mengering. Jika kita ingin memisahkan campuran yang mengandung lebih dari satu komponen maka kita harus mengubah kepolaran dari sistem pelarut yang digunakan sebelumnya.

Ø  Analisis fraksi

Jika fraksi yang diperoleh berwarna, kita dapat menggabungkan fraksi berdasarkan kesaman warna tapi jika fraksinya tidak berwarna, penggabunagn fraksi dapat dilakukan bedasrkan hasil KLT.

H.    Kelebihan dan Kekurangan Kromatografi Kolom

Ø  Kelebihan:

·         Dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparative

·         Digunakan untuk menentukan jumlah komponen campuran

·         Digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi

Ø  Kekurangan:

·         Untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan manual

·         Metode ini sangat membutuhkan waktu yang lama (time consuming)

REFERENSI

Anonim. 2012. Kromatografi Kolom. (Online). http://cheamistry.blogspot.com/2012/10/kromatografi-kolom.html (diakses pada 23 April 2013)

Purwanti, Ice. 2012. Kromatografi Kolom. (Online). http://icheanindita.blogspot.com/2012/05/kromatografi-kolom.html (diakses pada 23 April 2013)

Rohmatul, Rahmi. 2010. Hasil Analisis Kromatografi Kolom. (Online). http://akhwatmiew.blogspot.com/2010/12/hasil-analisis-kromatografi-kolom.html (diakses pada 23 April 2013)

Syaputri, Yolani. 2012. Kromatografi Kolom. (Online). http://yolanisyaputri.blogspot.com/2012/01/kromatografi-kolom.html (diakses pada 23 April 2013)

Wiryawan, Adam. 2011. Kromatografi Kolom. (Online). http://www.chem-is-try.org/wp-content/uploads/2010/09/gambar-18.22.jpg (diakses pada 23 April 2013)