1. Berdasarkan interaksi komponen dengan adsorben
a. Kromatografi adsorbsi
Dalam kromatografi adsorbsi, komponen yang dipisahkan secara selektif
teradsorbsi pada permukaan adsorben yang dipakai untuk bahan isian kolom.
b. Kromatografi partisi
Dalam kromatografi partisi, komponen yang dipisahkan secara selektif
mengalami partisi antara lapisan cairan tipis pada penyangga padat yang
bertindak sebagai fase diam dan eluen yang bertindak sebagai fase gerak.
c. Komatografi petukaran ion
Kromatografi petukaran ion memishkan komponen yang berbentuk ion.
Komponen-komponen tersebut yang terikat pda penukar ion sebagai fase diam
secara selektif akan terlepas/terelusi oleh fase gerak.
d. Komatogrfi filtrasi gel
Dalam kromatografi filtrasi gel, kolom diisi dengan gel yang permeabel
sebagai fase diam. Pemisahan berlangsung seperti proses pengayakan yang
didasarkan atas ukuran molekul dari komponen yang dipisahkan.
2. Berdasarkan gaya yang bekerja pada kolom
a. Kromatografi kolom gravitasi
Dalam kromatografi kolom gravitasi, eluen bergerak berdasarkan gaya
gravitasi atau perkolasi.
b. Kromatografi kolom tekanan
Dalam kromatografi kolom tekanan, eluen bergerak karena adanya
pemberian tekanan pada kolom. Tekanan yang diberikan tidak terlalu rendah dan
tidak terlalu tinggi.
3. Berdasarkan jenis fasa diam dan fasa gerak
a. Kromatografi Fase Normal
Kromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya “normal”
bersifat polar, misalnya silica gel, sedangkan fase geraknya bersifat
non polar.
b. Kromatografi Fase Terbalik
Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar, sedangkan
fase geraknya bersifat polar; kebalikan dari fase normal.
C. Adsorben
Silika gel (SiO2)
dan alumina (Al2O3) adalah 2 adsorben yang paling umum
digunakan untuk kromatografi kolom. Ukuran partikel dari adsorben sangat
berpengaruh pada bagaiman eluen bergerak melewati kolom. Partikel yang lebih
kecil (mesh lebih besar) digunakan untuk kromatografi kolom tekanan sedangkan
adsorben dengan ukuran partikel yang lebih besar digunakan untuk komatografi
kolom gravitasi. Alumina lebih sering digunakan dalam kromtografi kolom
dibanding kromtografi lapis tipis. Daya adsorbsi alumina dapat diatur dengan
mengatur jumlah air yang dikandung. Caranya ialah dengan mengeringkan alumina
pada suhu 360 0C selma 5 jam, kemudian membiarkan alumina kering tersebut
menyerap air sampai jumlah tertentu. Aktivitasnya tergantung dari kadar airnya
dan dinyatakan dalam skala Brockman.
D. Pelarut
Pelarut mempunyai peranan yang penting dalam mengelusi sampel yang dapat menentukan
keberhasilan pemisahan secaa kromatografi kolom. Pelarut yang mampu menjalankan
elusi terlalu cepat tidak akan mampu mengadakan pemisahan yang sempurna.
Sebaliknya elusi yang terlalu lambat akan menyebabkan waktu retensi yang
terlalu lama.
Sistem pelarut dengan kepolaran yang bertingkat sering juga digunakan
adalah pelarut mengelusi kolom. Dalam hal ini pelarut yang pertama kali
digunakan adalah pelarut non polar untuk mengelusi komponen yang kurang polar.
Pelarut yang lebih polar ditambahkan untuk mengelusi komponen yang lebih polar
juga.
E.
Syarat-syarat Adsorben dan Pelarut
·
Harus
memiliki luas permukaan besar internal. Kecepatan adsorbsi akan semakin
bertambah dengan semakin kecilnya ukuran diameter adsorben.
·
Harus
mudah diregenerasi
·
Tidak
cepat kehilangan kapasitas serap
·
Pemilihan
pelarut tergantung dari sifat kelarutannya, akan tetapi lebih baik untuk
memilih suatu pelarut yang tidak tergantung pada kekuatan elusi sehingga
zat-zat elusi yang lebih kuat dapat dicoba. “kekuatan” dari zat elusi adalah
daya penyerapan pada penyerap dalam kolom.
·
Wadah eluen (fase
gerak).
·
Kolom, biasanya
terbuat dari gelas yang berfungsi sebagai penunjang fase diam. Pada bagian
dasar dari kolom mempuny bentuk sedemikian rupa agar fase diam dapat tetap
dalam keadaan statis. Terdapat glass woll atau kapas, atau bahan dari pasir
kuarsa yang dikemas dengan kolom.
·
Wadah
penampung, untuk menampung Eluat dari kolom dalam bentuk
fraksi-fraksi. Pada dasarnya penampung dapat dilakukan secara manual, namun jik
total volume dari eluat besar dengan setiap fraksi yang diinginkan dalam volume
kecil, maka diperlukan suatu alat penampung tertentu. Untuk hal ini biasanya
digunakan suatu alat penampun otomatis yng dikenal sebagai kolektor.
G. Prosedur Kerja
a) Prosedur Untuk Kromatografi Kolom Gravitasi
Ø
Pengemasan Kolom
Pengemasan kolom adalah salah satu faktor penting untuk untuk mempeoleh
hasil pemisahan yang baik. Ada 2 cara pengemasan kolom (packing) dalam kromatografi
kolom gravitasi, yaitu:
Metode basah
Adsorben dicampur dengan pelarut, kemudian campuran dimasukkan ke dalam
kolom. Keuntungan dari metode ini adalah gelembung udara dapat dihilangkan dari
kolom. Contoh: kolom diisi dengan pelarut non polar seperti hekasana kira-kira
setengah dai tinggi kolom gels. Ditimbang sebnyak 8 gram alumina dalam gelas
piala sementara erlenmeyer 125 diisi 15 ml heksana. Dengan perlahan serbuk
alumina ditambahkan sedikit demi sedikit sambil diaduk. Gunakan pipet pasteu
untuk membut bubur, kemudian dengan cepat bubur tersebut dipipet dan dimasukkan
ke dalm kolom. Tempatkan erlenmeyer di bawh kolom kemudian buka screw clamp dan
biarkan pelarut mengalir. Teruskan penambahan bubur alumina sampai habis,
jangan lupa penambahan pelarut heksana terus dilakukan dan pelarut heksan yang
keluar dapat ditampung dan digunakan kembali untuk packing/menambah lagi
alumina ke dalam kolom. Jika packing sudah selesai, screw clamp ditutup, tinggi
cairan minimal sma dengan tinggi alumina. Kadang-kadang pasir juga ditmbahkan
pda puncak kolom untuk mencegah dari gangguan saat pelaut baru ditambahkan.
Metode kering
Metode ini lebih mudah tapi dapat menimbulkan adanya gelembung udara dalam
kolom. Gelembung udara ini harus dihindari, karena akan mengurangi resolusi
dari pemisahan. Contoh: Bagian dasar dari kolom diisi dengan glass woll
secukupnya. Pinch clamp ditutup dan kolom diisi dengan pelrut. Masukkan 8 gram
alumina ke dalam kolom gelas yang berisi pelarut dan biarkan pelarut mengalir.
Pinch clamp ditutup jika packing sudah selesai dan tinggi pelarut minimal sama
dengn tinggi alumina. Demikian juga hindai agar kolom tidak kering.
Pebandingan antara volume total kolom (cair+padat) dengan diameter kolom
yang optimal agar dipeoleh pemisahan yang baik, sulit dinyatakan secara tepat
dan ini dilakukan secara coba-coba secara sistematis. Secara umum, hanya dapat
dinyatakan bahwa kemasan kolom yang panjang akan memberikan tingkat pemishan
yang tinggi dan kolom yang lebar adalah baik untuk memisahkan komponen-komponen
dalam jumlah besar. Jenis fase diam yang digunakan adalah silika gel dan
alumina.
Ø Aplikasi sampel dan Proses Elusi
Sebelum sampel dimasukkan ke dalam kolom, pelarut dikeluarkan sedemikian
rupa hingga cairan di atas fase diam hmpir kering. Smpel dimasukkan pada bagian
atas dari fase diam dengan bantuan pipet tetes. Sejumlah kecil pengelusi (fase
gerak) digunakan untuk mencuci sissa sampel dalam wdah sampel dan selnjutnya
dimsukkan ke dalam kolom.
Setelah sampel dimasukkan, biasanya ditambah lagi eluen sedemikian rupa
hingga ketinggian fase gerak di atas fase diam 5-10 cm. Selanjutnya, hubungkan
dengan wadah fase gerak (proses elusi dilakukan) dan alirkan pengelusi
sedemikin rupa sehingg ketinggian cairan di atas fse diam dipertahankan. Proses
elusi dilakukan sampai komponen yang diinginkan keluar dari kolom.
Ø
Pengumpulan Fraksi
Pengumpulan fraksi dapat dilakukan secara manual dengan menggunakan tabung
reaksi yang sebekumnya diberi tanda sesuai dengan volume yang diinginkan atau
pada waktu tertentu yang ditetapkan sebelumnya. Pengumpulan ini dapat juga
dilakukan secara otomatis dengan bantuan kolektor fraksi. Jika tidak ada
prosedur tentang jumlah tiap fraksi yang harus dikumpulakn maka biasanya
diambil pendekatan yakni 2-5% dari volume total (cair+padat).
Ø
Deteksi Komponen
Deteksi komponen dapat dilakukan dengan teknik analisis seperti cara-cara
spektoskopi, KLT, dsb.
b) Prosedur Untuk Kromatografi Kolom Tekanan Skala Mikro
Kromatografi kolom
tekanan skala mikro merupakan metode yang paling sering digunakan dalam
laboratorium kimia organik karena mudah dilakukan dan ramah lingkungan.
Pemisahan terbaik jika jumlah sampel berkisar 25 mg.
Ø
Pengemasan kolom
Kolom dikemas dengan metode kering. Bagian bawah pipet pasteur disumbat
dengan kapas secukupnya. Tambahkan silika gel kering 230-400 mesh.
Ø
Pra elusi kolom
Untuk digunakan pelarut non polar sepeti hekasana. Heksana ditambahkan pada
bagian atas kolom (silika gel). Pelarut akan bergerak dengan perlahan, proses
pra elusi dpat dipercepat dengan bantuan bulb pipet untuk mendorong pelarut
melewati silika gel. Ketika batas pelarut sudh mencapai batas bawh dari kolom,
proses elusi selesai dan kolom siap digunakan.
Ø
Aplikasi sampel
Metode basah
Sampel dilarutkan dalam sejumlah kecil pelarut sepeti heksana, aseton dan
sebagainya. Larutan ini kemudioan dimasukkan ke dalam kolom.
Metode kering
Sampel dilarutkan salam sejumlah kecil pelaut dan tambahkan 100 mg silika
gel. Tunggu sampai pelarut menguap sehingga yang tertinggal hanya serbuk
kering. Masukkan sampel ke dalam kolom dengan bantuan kertas. Tambahkan pelarut
segar ke dalam kolom dan proses elusi pun siap dimulai.
Ø
Elusi kolom
Proses elusi untuk kromatografi kolom tekanan berskala mikro dilakukan
dengan cara menekan bulb yang ada di ujung pipet pasteur sehingga pelarut akan
bergerak melewati kolom. Jangan biarkan fase diam sampai mengering. Jika kita
ingin memisahkan campuran yang mengandung lebih dari satu komponen maka kita
harus mengubah kepolaran dari sistem pelarut yang digunakan sebelumnya.
Ø
Analisis fraksi
Jika fraksi yang diperoleh berwarna, kita dapat menggabungkan fraksi
berdasarkan kesaman warna tapi jika fraksinya tidak berwarna, penggabunagn
fraksi dapat dilakukan bedasrkan hasil KLT.
H.
Kelebihan dan Kekurangan Kromatografi Kolom
Ø
Kelebihan:
·
Dapat
digunakan untuk analisis dan aplikasi preparative
·
Digunakan
untuk menentukan jumlah komponen campuran
·
Digunakan
untuk memisahkan dan purifikasi substansi
Ø
Kekurangan:
·
Untuk
mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan manual
·
Metode
ini sangat membutuhkan waktu yang lama (time consuming)
REFERENSI
Anonim. 2012. Kromatografi Kolom. (Online). http://cheamistry.blogspot.com/2012/10/kromatografi-kolom.html (diakses pada
23 April 2013)
Purwanti, Ice. 2012. Kromatografi Kolom. (Online). http://icheanindita.blogspot.com/2012/05/kromatografi-kolom.html (diakses pada
23 April 2013)
Rohmatul, Rahmi. 2010. Hasil Analisis Kromatografi Kolom. (Online). http://akhwatmiew.blogspot.com/2010/12/hasil-analisis-kromatografi-kolom.html (diakses pada 23
April 2013)
Syaputri, Yolani. 2012. Kromatografi Kolom. (Online). http://yolanisyaputri.blogspot.com/2012/01/kromatografi-kolom.html (diakses pada 23 April 2013)
Wiryawan, Adam. 2011. Kromatografi Kolom. (Online). http://www.chem-is-try.org/wp-content/uploads/2010/09/gambar-18.22.jpg (diakses pada 23 April 2013)